參考周期：常規(guī)試驗(yàn)7-15工作日，加急試驗(yàn)5個工作日。

注意：因業(yè)務(wù)調(diào)整,暫不接受個人委托測試,望諒解(高校、研究所等性質(zhì)的個人除外)。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)步驟

　　1、劃線：先用 marker 筆在 6 孔板背后，用直尺比著，均勻的劃橫線，大約每隔 0.5～1cm 一道，橫穿過孔，每孔至少穿過 5 條線;

　　2、鋪板：處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，接種于 6 孔培養(yǎng)板;細(xì)胞鋪板 6w/孔，接種原則為過夜后融合率達(dá)到 100%，每孔最終的培養(yǎng)基總量 2mL;

　　3、細(xì)胞培養(yǎng) 37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h;

　　4、劃痕：第二天用 200 微升槍頭比著 6 孔板蓋子或直尺，平行或垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜;

　　5、清洗：PBS 沖洗細(xì)胞 3 次，除去劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基;

　　6、拍照：擦去 6 孔板背后的 marker 橫線劃痕。4 倍鏡下進(jìn)行拍照，保證劃痕居中且垂直，注意背景一致，加入待測樣本，設(shè)置濃度梯度，可按 0,6,12,24h 時間點(diǎn)取樣，拍照。

　　7、結(jié)果分析，使用 ImageJ 軟件打開圖片后，隨機(jī)劃取 6 至 8 條水平線，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值或者劃痕面積均值。

　　8、數(shù)據(jù)處理：

　　細(xì)胞遷移率(傷口愈合率)=(初始劃痕面積-t 時刻劃痕面積)/初始劃痕面積細(xì)胞遷移率(傷口愈合率)=(初始細(xì)胞間距離均值-t 時刻細(xì)胞間距離均值)/初始細(xì)胞間距離均值

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

　　1、劃線的目的只是為了輔助劃痕時劃的更直，有利于后續(xù)拍照分析，劃線會在拍照前擦去。

　　2、細(xì)胞接種數(shù)量需根據(jù)細(xì)胞生長速度和狀態(tài)而定，接種原則為過夜后融合率達(dá)到 100%，即細(xì)胞間沒有空隙，否則會影響后續(xù)拍照分析。

　　3、同濃度不同孔之間劃痕最好使用同一只槍頭，減少劃痕距離的誤差。劃痕時槍頭垂直，不能傾斜，可比著直尺或孔板蓋，保持力度一致，一次性劃完。

　　4、沖洗時要溫柔，貼壁加入，避免沖掉單層細(xì)胞，反復(fù)多次沖洗，盡量洗掉所有的細(xì)胞碎片。

　　5、降低細(xì)胞增殖對遷移造成的假陽性結(jié)果的方法：①使用無血清或低血清培養(yǎng)基(<2%)可降低細(xì)胞增殖對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響;②一般認(rèn)為 24h 為細(xì)胞的一個周期，在選取合適的時間點(diǎn)(6,12,24h)檢測劃痕寬度時，最好不要超過細(xì)胞一個周期的時間;③如果要單純考慮細(xì)胞遷移，可以先用絲裂霉素(1μg/ml)處理 1h，抑制細(xì)胞的分裂。

　　6、盡量保證各個劃痕寬度一致，人工槍頭制造劃痕難以保證劃痕寬度的一致性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這也是該方法最大的缺陷，有條件的同學(xué)可以選擇 culture Insert(如下圖)，將細(xì)胞接種于 Dish 中間的 Insert，培養(yǎng)。細(xì)胞長滿 Insert 區(qū)域后用鑷子移除 Insert 即可產(chǎn)生 500um、1000um 寬度的劃痕。

　　7、不是所有的細(xì)胞都適合劃痕實(shí)驗(yàn)，一些細(xì)胞呈團(tuán)簇狀生長，懸浮細(xì)胞更不能進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。

　　工程師會根據(jù)不同產(chǎn)品類型的特點(diǎn)、不同行業(yè)和不同國家的法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)以及客戶的需求，選取相應(yīng)的檢測項(xiàng)目和方法進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。

中析儀器 資質(zhì)